jueves, 29 de septiembre de 2011

[OFER-TRABEC] NAC: Beca predoctoral: Hemicanales de Cx43

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(Permitida la reproducción siempre que se cite la fuente de este Servicio).
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---Procedencia:
Institución:Institut de Recerca Vall d'Hebron; Lab, Cardiologia Experim.
Contacto correo-e:antonio.rodriguez.sinovas@vhir.org
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El Grupo de Investigación en Patología Cardiocirculatoria, ofrece un contrato de titulado superior-licenciado para trabajar en el proyecto: Papel de los hemicanales de conexina 43 en el daño por isquemia-reperfusión y en la protección por precondicionamiento

Perfil: Licenciado en ciencias de la salud (biología, farmacia, bioquímica, etc). Deberá tener interés por la investigación básica y querer realizar la tesis doctoral. Imprescindible conocimientos de inglés. Se valorará positivamente un buen expediente académico (imprescindible nota media superior a 1.6).

Tipus de contracte i retribució:
Contracte: Obra o Servei
Incorporació: Immediata
Retribució: Primera anualidad: 15.045,00 €, excluida la cuota patronal de la Seguridad Social. La retribución se distribuirá en 12 mensualidades. El programa tiene una duración de 3 años.

Tareas:
Los objetivos concretos del proyecto son: (1) Analizar el papel de los hemicanales de Cx43 en el daño por isquemia-reperfusión y los mecanismos implicados, incluyendo la liberación de metabolitos y la regulación del edema; (2) Estudiar su implicación en la protección por precondicionamiento y las vías por las que lo hacen; y (3) Diferenciar entre los efectos asociados a hemicanales de Cx43 y los asociados a otros tipos de hemicanales recientemente descritos en el miocardio como son los de panexina. Para cumplir estos objetivos se realizarán experimentos en corazón aislado de roedores (rata/ratón), sometidos a isquemia-reperfusión, así como en cardiomiocitos aislados, determinandose el tamaño del infarto y/o la liberación de enzimas intracelulares. Así mismo será necesario, entre otras tareas, determinar la expresión de proteínas mediante western blot y microscopía confocal. En caso necesario, se realizarán experimentos en modelos transgénicos.
Las tareas concretas del becario serán las de colaborar en el diseño de los experimentos, y la realización de los mismos, así como el posterior análisis estadístico, y la interpretación de los datos, siempre con apoyo de su director de tesis.

Dirección de contacto: antonio.rodriguez.sinovas@vhir.org


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Información complementaria de la oferta:
Dirección de contacto: antonio.rodriguez.sinovas@vhir.org

Se trata de solicitar una de las becas ofertadas por Institut de Recerca Vall d'Hebron de Barcelona, para trabajar en el laboratorio de Cardiologia Experimental. La duración total es de 3 años. La retribución se hará en 12 mensualidades.

Requisitos:

1. Licenciado en ciencias de la salud (Farmacia, Biología, Bioquímica, etc).

2. Imprescindible tener el título oficial de Máster universitario que conduzca a un doctorado o título de especialista.

3. Nota media del expediente académico igual o superior a 1.6 (escala 1-4). Imprescindible indicarlo en la respuesta. No se valorarán aquellas candidaturas en las que no esté expresamente indicada la nota media del expediente académico, así como aquellas en las que no conste que se tiene el título oficial de máster.

Fecha límite:

6 de Octubre de 2011.

Resumen del proyecto:

El daño miocárdico por isquemia-reperfusión es, a día de hoy, un problema sanitario de primer orden. Se asocia a patologías como el infarto agudo de miocardio, una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. Pero también se produce en el contexto de la cirugía cardíaca, en prácticamente todas las operaciones quirúrgicas rutinarias, que van desde el clampaje aórtico o el by-pass coronario hasta el transplante cardíaco. Actualmente, el tratamiento de elección para prevenir el daño por isquemia-reperfusión es restaurar, lo antes posible, el flujo en el área isquémica. Sin embargo, la reperfusión por sí misma inicia una cadena de procesos que pueden conducir a una muerte celular adicional (o daño por reperfusión). En parte por este motivo, y a pesar de la correcta aplicación de las técnicas de reperfusión, muchos pacientes con síndromes coronarios agudos con elevación del segmento ST acaban presentando extensas áreas de necros
is miocárdica, y, por ello, podrían beneficiarse de terapias adicionales. Aunque los mecanismos del daño por isquemia/reperfusión no se entienden completamente, sí que se conocen algunas de las vías implicadas. Ello ha permitido idear estrategias terapéuticas eficaces, al menos experimentalmente, a la hora de limitar la necrosis miocárdica, aunque su aplicación clínica ha sido, por el momento, limitada (Dirksen et al 2007).

Entre las estrategias terapéuticas que han demostrado, en estudios experimentales, una mayor eficacia a la hora de reducir el daño por isquema-reperfusión se encuentra el bloqueo de las "gap junctions", los canales intercelulares formados por conexina 43 (Cx43) responsables de la propagación del impulso eléctrico cardíaco. Nuestro grupo fue el primero en demostrar que las "gap junctions" participan en la propagación del daño miocárdico por isquemia-reperfusión. Así, diferentes bloqueantes farmacológicos han sido capaces de reducir el tamaño del infarto y la liberación de enzimas intracelulares en diferentes modelos animales, cuando se administran en el momento de la reperfusión (García-Dorado et al 1997; Rodríguez-Sinovas et al., 2004). Estos efectos protectores se correlacionaron con una menor recuperación de las propiedades eléctricas pasivas del miocardio, apoyando que estas drogas actuan realmente sobre las "gap junctions" (Rodríguez-Sinovas et
al., 2004). Igualmente, otros grupos han demostrado un papel similar de las "gap junctions" en la propagación del daño tisular en otras situaciones y tejidos (Rami et al., 2001; Frantseva et al., 2002; Little et al., 2002). Estudios posteriores en ratones transgéncicos knock-in, en los que la Cx43 se encuentra reemplazada por la Cx32, una conexina de origen hepático, con menor conductancia y permeabilidad, han confirmado la importancia de la Cx43 en el daño miocárdico por isquemia/reperfusión, ya que los corazones aislados y perfundidos de estos animales presentaron un menor tamaño del infarto al ser sometidos a isquemia-reperfusión (Rodríguez-Sinovas et al., 2010).

La Cx43 juega, así mismo, un papel clave en la protección por precondicionamiento. La deficiencia de Cx43 en animales heterocigotos Cx43+/- abole la protección por precondicionamiento (Schwanke et al., 2002). Curiosamente, este efecto es independiente de la comunicación a través de las "gap junctions", ya que cardiomiocitos aislados de estos animales deficientes para Cx43 tampoco pueden precondicionarse (Li et al., 2004). En este papel de la Cx43 en la protección por precondicionamiento puede ser esencial su presencia a nivel mitocondrial (Boengler et al., 2005; Rodríguez-Sinovas et al, 2006). Algunos datos apoyan esta hipótesis, como son que la protección por precondicionamiento se inhibe en los animales en los que la Cx43 está substituida por Cx32 (Rodríguez-Sinovas et al., 2010), lo que produce alteraciones en la permeabilidad mitocondrial a potasio (Miró-Casas et al.2009), así como si se inhibe la translocación de la Cx43 a dicho orgánulo con geldanamicina
(Rodríguez-Sinovas et al., 2006).

En este contexto es importante considerar que, si bien algunos de los trabajos mencionados apoyan de forma razonable el papel de las "gap junctions" o la Cx43 mitocondrial en estas funciones (Rodríguez-Sinovas et al., 2004; Li et al., 2004), la mayoría de estos estudios, en realidad, no son capaces de diferenciar entre los efectos asociados a "gap junctions" y los asociados a hemicanales. Los hemicanales están formados por la oligomerización de 6 moléculas de Cx43 alrededor de un poro central, y se encuentran en la membrana libre de la célula. Al deplazarse hacia los discos intercalares y contactar con otro hemicanal de una célula adyacente es cuando forman las "gap junctions". Pues bien, tanto los fármacos utilizados en los trabajos previos, como los modelos transgénicos, afectan por igual a ambas estructuras.

Tradicionalmente se había considerado que los hemicanales deberían estar cerrados, ya que su apertura provocaría la pérdida de la homeostasis celular. Sin embargo, actualmente se sabe que los hemicanales están sometidos a una estricta regulación (Saez et al., 2005), y que su apertura controla importantes funciones, incluyendo la muerte y supervivencia celular (Rodríguez-Sinovas et al, 2007). Entre los mecanismos por los que los hemicanales de Cx43 pueden participar en la muerte celular estarían su capacidad para liberar metabolitos intracelulares, como ATP o glutamato, al espacio extracelular, así como su participación en la regulación del volumen celular. En tejidos no cardíacos se ha descrito que sus acciones paracrinas podrían tener un efecto dual sobre la muerte celular. Por un lado, una liberación sostenida de dichos metabolitos provocaría un efecto tóxico directo sobre las células adyacentes, al actuar sobre receptores específicos, y provocar un aument
o en la concentración citosólica de calcio (Braet et al., 2003). De hecho, los hemicanales se abren en condiciones de deprivación energética (John et al., 2003), lo cual favorecería la expansión del daño tisular. Por otro lado, una liberación transitoria de mediadores intracelulares a través de los hemicanales puede ser fundamental para la protección por precondicionamiento (Lin et al., 2008). Finalmente, el propio precondicionamiento puede inhibir la apertura de los hemicanales durante la isquemia prolongada, reduciendo el efecto tóxico de los metabolitos liberados (Miura et al., 2010). A esta función paracrina habría que añadir su papel sobre el edema celular, una de las características más importantes del daño isquémico, y que puede no ser sólo una consecuencia de la muerte celular, sino también contribuir activamente a la misma. Así, se ha demostrado que diferentes tipos célulares carentes de Cx43 presentan menores aumentos en volumen que si sobreex
presan Cx43, tras ser sometidas a reducciones del calcio ext!
racelula
r (Quist et al., 2000).

La mayoría de los estudios existentes sobre hemicanales y su papel en la muerte celular se han realizado en células gliales, neuronales o endoteliales, y poco se sabe sobre sus efectos en cardiomiocitos. Aunque se ha sugerido que la inhibición metabólica produce su apertura en este tipo celular (John et al., 2003), y un estudio previo ha sido capaz de reducir el tamaño del infarto en corazones aislados de rata utilizando bloqueantes péptidicos selectivos contra los hemicanales de Cx43 (Hawat et al., 2010), no se conoce ni los mecanismos por los que participarían en el daño miocárdico por isquemia/reperfusión, ni su papel en la protección por precondicionamiento o en la regulación del edema. Averiguar si son los hemicanales o las "gap junctions" las que participan en el daño por isquemia-reperfusión puede ser de gran utilidad, ya que podría abrir nuevas vías de tratamiento en pacientes con síndrome coronario agudo o sometidos a cirugía. Los hemicanales, al co
ntrario que las "gap junctions", son perfectamente accesibles con tratamientos farmacológicos convencionales, ya que se encuentran en la membrana libre celular. Por todo ello los objetivos de este proyecto son: (1) Analizar el papel de los hemicanales de Cx43 en el daño por isquemia-reperfusión y los mecanismos implicados, incluyendo la liberación de metabolitos y la regulación del edema; (2) Estudiar su implicación en la protección por precondicionamiento y las vías por las que lo hacen; y (3) Diferenciar entre los efectos asociados a hemicanales de Cx43 y los asociados a otros tipos de hemicanales recientemente descritos en el miocardio como son los de panexina, una proteína homóloga a las inexinas, que es la encargada de formar las "gap junctions" en los invertebrados (Baranova et al., 2004).

Métodos:

1. PAPEL DE LOS HEMICANALES DE Cx43 EN EL DAÑO POR ISQUEMIA-REPERFUSIÓN Y LA PROTECCIÓN POR PRECONDICIONAMIENTO: ESTUDIOS EN CORAZÓN AISLADO DE RATÓN. En las fases iniciales se utilizarán corazones aislados de ratón, perfundidos de forma retrógrada a través de la aorta con una solución de Krebs-bicarbonato oxigenada y a 37ºC, tal y como ya ha sido descrito (Rodríguez-Sinovas et al 2010). Se monitorizará la presión ventricular izquierda y la presión de perfusión. Los corazones serán sometidos a isquemia global de tiempo variable (37ºC) y reperfusión de 1 h, determinándose la recuperación funcional, la liberación de enzimas intracelulares (LDH), y el tamaño del infarto (tinción de trifeniltetrazolio).

El desarrollo de péptidos específicos dirigidos contra secuencias extracelulares de las distintas conexinas ha permitido disponer, dependiendo del tiempo de incubación, de una herramienta indispensable para diferenciar entre efectos debidos a hemicanales y a "gap junctions" (Dahl, 2007). Utilizaremos los péptidos Gap26 y/o Gap27 para inhibir los hemicanales formados por Cx43, usando péptidos con secuencia alterada ("scrambled peptides") como control. Estos péptidos se añadirán a la perfusión de Krebs, en diferentes momentos del experimento, y se compararán los efectos sobre la muerte celular con la hallada en corazones control.

Para estudiar el papel en el precondicionamiento, los corazones serán sometidos a 4 ciclos de isquemia (3.5 min) y reperfusión (5 min) previos a la isquemia índice. El tratamiento con los péptidos se hará durante los propios ciclos precondicionantes.

2. PAPEL DE LOS HEMICANALES DE Cx43 EN EL DAÑO POR ISQUEMIA-REPERFUSIÓN Y LA PROTECCIÓN POR PRECONDICIONAMIENTO: ESTUDIOS EN CARDIOMIOCITOS AISLADOS DE RATÓN. Este modelo permitirá confirmar que los efectos encontrados son realmente debidos a acciones de los hemicanales, ya que las células se mantendrán a bajas densidades para evitar que estén unidas por "gap junctions". Se obtendrán cardiomiocitos aislados frescos a partir de corazones de ratón mediante perfusión con colagenasa (Li et al., 2004). Las células serán sometidas a 20 min de anoxia a 37ºC con tampón libre de glucosa y 15 minutes de reperfusión, en presencia o ausencia de los péptidos inhibidores correspondientes, con y sin precondicionamiento. La muerte celular se determinará mediante marcaje con Trypan blue y liberación de LDH.

En este modelo, y si hemos sido capaces de demostrar que los hemicanales juegan un papel en el daño por isquemia-reperfusión, intentaremos averiguar si el precondicionamiento tiene alguna acción sobre la apertura de los mismos inducida por deprivación energética. La apertura de los hemicanales se monitorizará mediante marcaje fluorescente con substancias permeables a través de los mismos (Lucifer Yellow, calceína), compararando el incremento de marcaje durante la isquemia (lo que denotaría apertura de hemicanales) en presencia y ausencia de precondicionamiento. Se comprobará que dicho marcaje sea sensible a los bloqueantes peptídicos.

3. PAPEL DE LOS HEMICANALES DE Cx43 EN EL DAÑO POR ISQUEMIA-REPERFUSIÓN EN MODELOS TRANSGÉNICOS. La utilización de los modelos transgénicos permitirá determinar la dependencia de estas respuestas de la presencia de Cx43. Para ello utilizaremos ratones knock-in Cx43KI32, en los que la Cx43 se encuentra reemplazada por Cx32, y ratones en los que se induce deficiencia de Cx43 mediante inyección intraperitoneal de 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT). Ambos tipos de animales ya han sido utilizados en estudios previos (Rodríguez-Sinovas et al., 2010). Se realizarán tanto estudios en corazón aislado, como en cardiomiocitos, en presencia y ausencia de los bloqueantes peptídicos apropiados. Teóricamente, en los modelos deficientes para Cx43 o substituidos por otra conexina, los hemicanales deberían ser menos operativos, y deberíamos ver, además de diferencias en el daño o en la protección, cambios en las acciones de los bloqueantes peptídicos. La apertura de los hemicanales
se testará, como en el punto anterior, mediante marcaje fluorescente en los cultivos celulares.

4. PAPEL PARACRINO DE LOS HEMICANALES DE Cx43 EN EL DAÑO POR ISQUEMIA-REPERFUSIÓN Y EN LA PROTECCIÓN POR PRECONDICIONAMIENTO. Para estudiar si existe liberación de metabolitos, se tomarán muestras tanto del efluente coronario de los corazones aislados, como del sobrenadante de los cultivos celulares. Los factores humorales liberados se purificarán y concentrarán mediante HPLC (Serejo et al 2007). Las diferentes fases obtenidas de los eluyentes de las columnas de HPLC deberán testarse en los modelos previos para confirmar a cual de ellas corresponde el efecto. Tras la purificación, se analizará su sensibilidad a la temperatura, su hidrofobicidad y se intentará su determinación química mediante resonancia magnética nuclear o espectrometría de masas.

5. PAPEL DE LOS HEMICANALES DE Cx43 EN EL DAÑO POR ISQUEMIA-REPERFUSIÓN. MEDIACIÓN A TRAVÉS DE RECEPTORES DE MEMBRANA Y MECANISMOS INTRACELULARES. Para estudiar si los efectos encontrados están mediados por receptor se utilizarán, en los modelos comentados, antagonistas de los distintos mediadores posiblemente involucrados: de receptores purinérgicos, de adenosina, opioides, etc., dependiendo en gran medida del resultado obtenido en el estudio previo. De forma similar, se analizarán las vías intracelulares implicadas mediante bloqueo de la producción de IP3, estudio del aumento de las concentraciones citosólicas de calcio (microscopía confocal), etc.

6. PAPEL DE LOS HEMICANALES EN EL CONTROL DEL EDEMA INTRACELULAR. Para analizar este punto, realizaremos estudios de resonancia magnética nuclear, tanto tras inhibir los hemicanales con bloqueantes peptídicos, como utilizando corazones de animales trasngénicos carentes de Cx43. El aumento del edema intracelular en estos corazones se inducirá mediante reducciones en las concentraciones de calcio extracelular, y mediante isquemia-reperfusión. Para distiguir entre edema intra y extracelular, se utilizará marcaje con gadolinio-DOTA, incapaz de atravesar las membranas, mientras que el edema total se determinará por desecación a 100ºC. Se evitará al máximo la presencia de muerte celular que pueda dificultar la interpretación de los resultados (poco tiempo de isquemia o perfusión con blebistatina, etc).

7. PAPEL DE LOS HEMICANALES DE PANEXINA EN EL DAÑO MIOCARDICO POR ISQUEMIA-REPERFUSION Y EN LA PROTECCIÓN POR PRECONDICIONAMIENTO. Puesto que los hemicanales de panexina pueden también participar en la protección por precondicionamiento mediante la liberación de metabolitos intracelulares (Vessey et al 2010), parece interesante diferenciar entre los efectos debidos a ambos tipos de hemicanales. Mientras que los canales de conexina se inhiben selectivamente con los péptidos mencionados, los de panexina se inhiben de forma más o menos selectiva mediante probenecid (Silverman et al 2008). Por ello usaremos esta droga en los modelos de corazón y cardiomiocitos aislados para intentar analizar su papel en el daño por isquemia-reperfusión y protección por precondicionamiento.

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